核内Beclin1的生物学作用

【摘要】目的：本文旨在探索Beclin1蛋白非自噬相关的新功能,试图探讨Beclin1蛋白的核定位机制,及其在细胞核中的生物学作用。方法：(1)选取c57小鼠不同发育时间点的肝脏组织,免疫荧光法观察Beclin1蛋白在动物发育过程中的亚细胞定位变化。(2)在基础自噬、激活自噬水平的情况下,体外免疫共沉淀法检测NIH3T3细胞胞质及细胞核内,Beclin1蛋白与PI3KC3、Bcl-2的结合情况,试图探究核内Beclin1蛋白的功能是否是自噬相关的。(3)利用Talen技术体外构建beclin1基因敲除NIH3T3细胞系。利用流式PI染色、细胞计数、WesternBlotting等方法检测Beclin1蛋白表达下调对细胞周期的影响。(4)给予野生型NIH3T3细胞γ射线辐照后,分离胞质及核蛋白,WesternBlotting检测Beclin1在细胞胞质及核中的表达情况。(5)利用OverlapPCR分段缺失Beclin1蛋白序列,WesternBlotting检测介导Beclin1蛋白入核的核定位序列。(6)利用核内蛋白PullDown技术,结合LC-MS/MS质谱分析技术,检测在核内可能与Beclin1相互作用的蛋白。结果：(1)小鼠的发育过程中,随着年龄的增长,Beclin1蛋白在肝脏组织细胞中呈现核定位增加趋势。(2)Beclin1蛋白在细胞核中的功能可能是非自噬相关的。(3)Beclin1蛋白参与细胞周期调控,在Beclin1蛋白表达下调时,细胞周期被阻滞在G2/M期。(4)Beclin1蛋白与Y射线引起的DNA损伤修复有关,在给予γ射线辐照时,核内Beclin1蛋白在DNA损伤加剧时呈现表达升高现象,而细胞胞质及总的Beclin1蛋白无明显现象。(5)分段缺失Beclin1蛋白的主要功能域,发现位于188-241和267-325位的氨基酸序列可能是介导Beclin1蛋白入核的非经典的入核序列。(6)体外PullDown实验结果显示,Beclin1蛋白在核内与DNA拓扑异构酶Ⅱβ存在相互结合作用。结论：Beclin1蛋白在细胞核中的功能是非自噬相关的,其在核中的功能可能细胞周期及DNA损伤修复的调控有关。迄今,关于Beclin1蛋白亚细胞定位的认识,认为其主要分布于细胞胞质中。并且主要在胞内参与自噬过程。我们的研究首次发现Beclin1在小鼠体内存在发育相关的核定位现象,这颠覆了我们以往对于这个蛋白的亚细胞定位的认识。并且我们发现Beclin1蛋白在细胞核中起着非自噬相关的功能,并且我们首次发现Beclin1蛋白在细胞核中可能与Ⅱ型的DNA拓扑异构酶β存在结合作用。因此,本研究是一个原创性的发现。
【作者】徐非；
【导师】王建荣；
【作者基本信息】苏州大学，发育生物学，2014，硕士
【关键词】Beclin1；核定位；发育；细胞周期；DNA损伤修复；

【参考文献】
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